Long Lis Gruppe an der School of Life Sciences der Peking University veröffentlichte einen Artikel mit dem Titel „Molekularer Weg des mitochondrialen Präproteinimports durch den TOM-TIM23-Superkomplex“, erschienen in Nature Structural & Molecular Biology. Die Studie berichtet über strukturelle und biochemische Ergebnisse des TOM-TIM23-Superkomplexes, der den Proteintransport in Mitochondrien vermittelt, enthüllt einen neuen Weg des Proteinimports durch den TOM-Komplex über die äußere Mitochondrienmembran und definiert die Kernzusammensetzung des TIM23-Transporterkomplexes in der inneren Mitochondrienmembran neu.
Als eines der wichtigsten Organellen in eukaryotischen Zellen spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Energieversorgung, dem intrazellulären Stoffwechsel, der Homöostase und der Apoptose. Mitochondrien haben eine einzigartige innere und äußere Lipidmembranstruktur mit zwei Schichten, in deren Inneren mehr als 1.000 Proteine verteilt sind. 99 % der mitochondrialen Proteine werden durch zytosolische Gene kodiert, in Ribosomen im Zytoplasma synthetisiert und über die Membran zu den Mitochondrien transportiert, um dort ihre Funktionen zu erfüllen. Daher ist der Transport mitochondrialer Proteine für die Aufrechterhaltung und Regulierung der mitochondrialen Aktivität von entscheidender Bedeutung, und Mutationen in verwandten Genen stehen in engem Zusammenhang mit der Entwicklung vieler Stoffwechselerkrankungen und Krebserkrankungen beim Menschen. Die Gruppe von Li Long hat daran gearbeitet, die molekularen Mechanismen zu erforschen, durch die mitochondriale Proteine in die Mitochondrien gelangen, und veröffentlichte Arbeiten umfassen die Aufklärung des Weges, über den mitochondriale Membranproteine über den TIM22-Transportkomplex in die innere Membran gelangen (Zhang Y. et al. Cell Research 2021). Die Rolle des TOM-TIM23-Superkomplexes beim mitochondrialen Proteintransport ist in dieser Studie noch wichtiger. Dieser Superkomplex, der aus Dutzenden von Proteinuntereinheiten zusammengesetzt ist, überspannt die inneren und äußeren mitochondrialen Doppelschichtmembranen und steuert den Transport von mehr als 500 löslichen mitochondrialen und Membranproteinen. In den letzten 40 Jahren haben Forscher die einzelnen Untereinheiten der TOM- und TIM23-Transportkomplexe umfassend und intensiv untersucht. Aufgrund der hochdynamischen Natur dieses Superkomplexes ist das Verständnis der zentralen Frage, wie sich diese Untereinheiten zum Proteintransportweg zusammensetzen, jedoch noch sehr begrenzt. Dies gilt insbesondere für den TIM23-Komplex in der endosomalen Membran, bei dem die Zusammensetzung der Kerntransporteinheit sehr unklar ist.
In dieser Studie begannen die Autoren zunächst mit der Zusammenstellung eines stabilen TOM-TIM23-Superkomplexes, untersuchten verschiedene Zusammenstellungsschemata und entschieden sich schließlich für die Fusion von grün fluoreszierendem Protein mit mitochondrialem Protein als Transportsubstrat und erfassten den Zwischenzustand des TOM-TIM23-Superkomplexes für den Transport von Proteinsubstraten in Hefezellen. Nach der In-vitro-Reinigung konnte dieser Zwischenzustand für weitere strukturbiologische und biochemische Studien noch stabilisiert werden. Durch Einzelpartikelanalyse dieses Zwischenzustands mittels Kryo-Elektronenmikroskopie stellten die Autoren fest, dass eine direkte Wechselwirkung zwischen dem in der äußeren Membran gelegenen TOM-Komplex und dem in der inneren Membran gelegenen TIM23-Komplex besteht, der die innere und äußere Mitochondrienmembran verbindet und das Proteinsubstrat effizient von der äußeren Mitochondrienmembran zur inneren Membran transportiert (Abb. 1a). Insbesondere wurde der TOM-Komplex mit einer Auflösung von 4,1 Å aufgelöst. Die Struktur enthüllte einen „polaren Aminosäureweg“ innerhalb der Innenwand der Tom40-Kanaluntereinheit, der artenübergreifend konserviert ist und den Durchgang des Proteinsubstrats durch die Tom40-Zwischenpore in entfalteter Form vermittelt (Abb. 1b). Dieser Weg unterscheidet sich von den beiden zuvor auf Grundlage biochemischer Experimente vorgeschlagenen Transmembranwegen in Tom40 und demonstriert die Vielseitigkeit des TOM-Komplexes bei der effizienten Erkennung und dem Transport verschiedener mitochondrialer Proteine.
Abb. 1. Struktur des TOM-TIM23-Superkomplexes. (a) Schematische Darstellung des Aufbaus und der Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur des TOM-TIM23-Superkomplexes. (b) Kryo-Elektronenmikroskopie-Strukturmodell des TOM-Komplexes, der das Proteinsubstrat enthält. (c) AlphaFold2-Strukturmodell des Tim17-Tim23-Mgr2-Heterotrimers
Darüber hinaus führten die Autoren systematisch unnatürliche Aminosäuren an verschiedenen Stellen des Proteinsubstrats ein und untersuchten die Umgebung des Proteinsubstrats im Transportweg von TOM-TIM23 mittels Photovernetzung. Auf diese Weise identifizierten sie die Kernuntereinheit, die dem Substrat direkt dabei hilft, die beiden Lipidmembranen zu durchqueren. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass das C-terminale Fragment des Proteinsubstrats mit der Tom40-Untereinheit der äußeren Membran vernetzt werden kann, ein Ergebnis, das mit Strukturbeobachtungen übereinstimmt. Überraschenderweise vernetzt sich das N-terminale Fragment des Proteinsubstrats jedoch sowohl mit der Tim17- als auch der Mgr2-Untereinheit in der inneren Membran, nicht jedoch mit der Tim23-Untereinheit, die üblicherweise als Bestandteil des inneren Membrantransportkanals angesehen wird. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass es in früheren Studien möglicherweise eine erhebliche Verzerrung bei der Wahrnehmung des Kerntransportwegs des TIM23-Komplexes gab. Um die Kerntransporter-Untereinheiten und -Wege in TIM23 weiter zu identifizieren, verwendeten die Autoren eine Kombination aus AlphaFold2-Modellierung, biochemischer Vernetzung, Hefegenetik und In-vitro-Transport mitochondrialer Proteine und fanden heraus, dass die Kernkomponente des TIM23-Komplexes ein Heterotrimer ist, das aus den Untereinheiten Tim23, Tim17 und Mgr2 besteht, wobei Tim17 und Mgr2 gegenüberliegend eine kanalartige Struktur bilden, während Tim23 in einer Rücken-an-Rücken-Form an Tim17 bindet und nicht an der Kanalbildung beteiligt ist (Abb. 1c). Während der Proteintranslokation passiert das Proteinsubstrat die kanalartige Struktur, die von Tim17 und Mgr2 gebildet wird, und kommt nicht direkt mit der Tim23-Untereinheit in Kontakt. Mutagenese-Experimente zeigten, dass der Knockdown von Mgr2 in Hefe die Proteintranslokation nicht beeinflusste, was darauf hindeutet, dass in der kanalartigen Struktur, die von Tim17 und Mgr2 gebildet wird, nur Tim17 erforderlich ist. Der Grund, warum Tim17 Proteinen helfen kann, die endosomale Membran zu durchqueren, liegt in seiner einzigartigen Aminosäureverteilung auf der Oberfläche: Einerseits hat Tim17 eine hochkonservierte negativ geladene Region am Eingang der endosomalen Membran, die die lokalisierte Struktur der Phospholipid-Doppelschicht stören und die Energiebarriere für Proteine zum Durchqueren der Lipidmembran senken kann; andererseits hat Tim17 eine konservierte hydrophobe Region in der Mitte des Pfades, die hilft, die innere Membran des Mitochondriums luftdicht zu halten und das für die physiologischen Aktivitäten der Mitochondrien notwendige Membranpotential aufrechtzuerhalten. Zusammenfassend kann man aus den Ergebnissen verschiedener struktureller und biochemischer Experimente schließen, dass der TIM23-Komplex mit der Tim17-Untereinheit in seinem Kern einen gemischten Modus annimmt, um die Proteintranslokation zu unterstützen. Das heißt, Tim17 kann sich entweder dynamisch mit anderen Untereinheiten verbinden, um einen Kanal zu bilden, der Proteinen beim Durchqueren der Membran hilft, oder Tim17 arbeitet im Insertionsenzym-Arbeitsmodus, um die Proteintranslokation allein durchzuführen, ohne dass eine Kanalbildung erforderlich ist. Dieses Ergebnis korrigiert die in diesem Bereich in den letzten 40 Jahren vorherrschende Fehleinschätzung, dass die Tim23-Untereinheit einen Kernkanal darstellt.
Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Studie eine neuartige Strategie für Untersuchungen des Proteintransports entwickelt, der entscheidende Weg für mitochondriale Proteine aufgedeckt, über den sie die Doppelschichtlipidmembran über den TOM-TIM23-Superkomplex durchqueren (Abbildung 2), das langjährige Fachwissen zu den Kernkomponenten des inneren Membran-Transportkomplexes TIM23 auf den Kopf gestellt und eine völlig neue Funktionsweise von Proteintransportenzymen entdeckt, die eine solide Grundlage für ein umfassendes und tiefgehendes Verständnis der mitochondrialen Biosynthese legt.
Abbildung 2. Mitochondrialer TOM-TIM23-Transporterweg
Long Li ist der korrespondierende Autor des Papiers, und Xueyin Zhou, ein Doktorand des Peking University-Tsinghua Joint Center for Life Sciences (Abschlussjahrgang 2018), Yuqi Yang, ein Doktorand des School of Life Sciences (Abschlussjahrgang 2019), Dr. Peng Wang von der Kryo-Elektronenmikroskopie-Plattform der Peking University und Shanshan Wang, ein Doktorand des School of Life Sciences (Abschlussjahrgang 2020), sind die Co-Erstautoren. Dongjie Sun, ein ehemaliger Techniker in Li Longs Labor, Xiaomin Ou, ein Doktorand des College of Life Sciences (Abschlussjahrgang 2022), und Yuke Lian, ein Doktorand des College of Life Sciences (Abschlussjahrgang 2021), haben bedeutende Beiträge zu dieser Forschung geleistet. Prof. Ning Gao und der assoziierte Forscher Ningning Li von der School of Life Sciences der Peking-Universität sowie der Forscher Xinzheng Zhang vom Institut für Biophysik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften leisteten große Hilfe bei der Berechnung der Kryo-Elektronenmikroskopiedaten, und Prof. Qing Li und Prof. Gain Chang von der School of Life Sciences der Peking-Universität lieferten wichtige Hinweise zu Hefegenetik bzw. Photovernetzungsexperimenten. Die Forschungsarbeit wurde von der Kryo-Elektronenmikroskopie-Plattform der Peking-Universität, dem High Performance Computing Center, dem Instrumentation Center der School of Life Sciences und der National Phoenix Protein Platform unterstützt und vom State Key Laboratory of Membrane Biology, dem Peking University-Tsinghua Joint Center for Life Sciences und der National Natural Science Foundation of China finanziert.
